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甲基强的松龙对深低温停循环大鼠脑保护作用的研究
          作者:顾群,莫绪明,陈凤,彭卫,何晓敏,戚继荣,顾海涛

【摘要】  目的 观察甲基强的松龙(MP)对深低温停循环(DHCA)大鼠脑N 甲基 D 天门冬氨酸受体R1(NMDAR1)表达的影响,探讨MP对DHCA大鼠脑保护作用的机制。 方法 制作大鼠DHCA模型。雄性SD大鼠175只,随机分为假手术组、DHCA模型组和MP处理组。观察DHCA 60 min,再灌注2、6、12 h及1、2、3、7 d时NMDAR1蛋白表达的变化以及脑组织超微结构变化。结果 免疫组化结果显示,DHCA模型组和MP处理组大鼠NMDAR1蛋白表达均升高,于1 d到达高峰,后逐渐降低,于再灌注7 d恢复至正常水平。MP处理组大鼠再灌注后2、6、12 h,1、2 d 5个时间点NMDAR1表 达明显低于模型组(P<0.01)。脑组织超微结构观察发现MP能抑制DHCA脑细胞凋亡。 结论 MP对DHCA大鼠脑 组织具有保护作用,其作用机制之一可能是与抑制NMDAR1蛋白表达有关。

【关键词】  深低温停循环;甲基强的松龙;N-甲基-D-天门冬氨酸受体R1;脑保护;蛋白表达

  深低温停循环(deep hypothermic circulatory ar-  rest,DHCA)技术自上世纪50年代诞生以来,已广泛应用于复杂和严重的先天性心脏病及大血管手术中,但其可能并发脑损伤的问题尚未得到较好解决,DH-CA术后中枢神经系统的发病率高达4%~25%。DHCA手术后患者近期不同程度出现手足舞蹈症、抽搐,远期出现认知障碍,儿童出现智力发育障碍等神经系统并发症[1]。DHCA后脑组织缺血缺氧导致突触前兴奋性氨基酸(EAA)大量释放和再摄取减少,从而激活突触后N 甲基D 天门冬氨酸(NMDA)和α氨基 3羟基 5甲基4异戊丙酸(AMPA)受体,引起大量K+外流和Na+、Ca2+内流,造成渗透分解和Ca2+相关性损害。本实验通过观察甲基强的松龙(MP)对DHCA大鼠脑NMDA受体1(NMDAR1)蛋白表达的影响,以探讨其脑保护机制。   

  1 材料与方法   

  1.1 仪器与试剂 

  早产儿培育箱、自制大鼠冰窝、水合氯醛(南京市儿童医院提供)、MP(美国辉瑞制药公司)、NMDA受  体R1 (Santa Cruz公司),羊抗兔即用型SABC免疫组化检测试剂盒SA1022(武汉博士德公司)、DAB显色剂(武汉博士德公司)、多聚赖氨酸(美国Sigma公司)、荧光倒置显微镜(德国蔡司)、801图像分析系统(江苏  捷达)。  

  1.2 动物 

  成年健康雄性普通级SD大鼠(南京医科大学实验  动物中心)175只,体重250~300 g,随机分为3组,A组(假手术组)15只;B组(DHCA模型组)和C组(MP处理组)各80只,每组再分为DHCA后2、6、12 h,1、2、3、7 d共7个小组,每小组10只,其中DHCA后6 h、1 d 两个组为15只。术前6 h 禁食禁水。A组仅暴露双侧颈总动脉,不降温不阻断;B组深低温停循环60min;C组于深低温停循环前30 min腹腔注射MP,剂  量为30 mg ·kg-1。  

  1.3 大鼠DHCA模型建立 

  术前30 min肌肉注射阿托品0.02 mg·kg-1,5%水合氯醛6 ml · kg-1腹腔注射麻醉,大鼠仰卧固定于实验台上。温度计插入肛门3 cm,用胶带将其与鼠尾相  固定,监测肛温。颈部正中切口,分别游离两侧颈总动脉及左、右颈外动脉,并双重过线。游离一侧股动脉,动脉置管,取动脉血作血气分析后,用肝素充满连接管后接压力换能器,多功能监护仪监测血压、心电变化及外周血氧饱和度。最后将大鼠放入特制的冰窝,物理降温,每隔5   min记录体温、心率、血压以及血氧饱和度,调整降温速度。当肛温降至21 ℃时,将大鼠取出,取动脉血做血气分析后,经左股动脉进行肝素化(肝素钠300 IU ·kg-1)。随后用24G静脉留置针顺行穿刺左颈外静脉,扎线固定后与三通相连。接着阻断两侧颈总动脉,最后用24G静脉留置针逆行穿刺颈外动脉,扎线固定   留置针,与左侧颈外静脉的静脉留置针相连,开始转流。转流后,将体温维持在(21±1)℃之间,并记录体温、心率、血压以及血氧饱和度。停循环60 min后,拔出颈外动脉处留置针并结扎,回收其管道内血液,经左侧颈外静脉输入,再退出其管内留置针并结扎。最后  松开两侧颈总动脉处动脉夹,恢复颈总动脉血流,检查穿刺处无出血后,逐层缝闭切口。然后将大鼠放入35   ℃早产儿培育箱复温,恢复正常体温4 h后放置室温下正常饲养。  
  1.4 免疫组化方法

  检测NMDAR1蛋白表达各组取10只大鼠于DHCA后相应时间点,用含4%多聚甲醛的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液经心脏升主动脉灌流固定,断头置于冰盒玻璃板上取出全脑,放入同样固定液中再固定约24 h,常规脱水石蜡包埋切片,厚度4μm,取4张连续切片,操作步骤按SABC试剂盒  操作说明进行,阴性对照以PBS代替一抗。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值,每张切片随机选择4个高倍视野(×400)观察并取其平均值,以灰度值来表示NMDAR1的表达水平,灰度值越高,免疫组化染色越浅,NMDAR1表达越低。  

  1.5 脑组织超微结构观察 

  于DHCA再灌注后6 h和1 d,各组取5只大鼠处死,每只大鼠于海马区取1 mm×1 mm×1 mm的小块  组织,于2.5%戊二醛固定后,经0.1 mol·L-1的磷酸  缓冲液冲洗,1%锇酸固定,丙酮脱水,纯树脂浸透包  埋,固化后切片。切片厚度为50~60 nm,醋酸铀与枸缘酸铅染色,透射电镜下观察神经元及神经胶质细胞超微结构的变化。  

  1.6 统计学处理 
  
  所有数据以x-±s 表示,用SPSS 11.0软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析并以LSD法比较两两差异,P <0.05 为差异有统计学意义。
       
  2 结  果   

  2.1 免疫组化表达 

  见表1。DHCA模型组和MP处理组大鼠脑  NMDAR1蛋白从再灌注2 h起开始升高,于24 h到达高峰( P <0.01),后逐渐下降,于7 d后基本恢复正常  水平。同时在2、6、12 h,1、2 d 5个时间点,MP组大鼠  脑NMDAR1蛋白表达明显低于DHCA模型组(P<0.01 )。表1 各组大鼠各时间点脑NMDAR1蛋白表达(略)

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