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氟西汀对海马神经元生长的影响

【关键词】  氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠

  氟西汀是5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂之一,是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外,尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明,氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之 一[1]。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道,本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。   

  1 材料与方法   

  1.1 新生大鼠海马神经元的分离和培养 

  技术方法在参考文献[2]基础上加以改进。取出生24 h内的新生SD大鼠(东南大学医学院动物实验中心提供),无菌分离出双侧海马,用显微剪剪碎,D-Hank's液清洗2或3次,将剪碎的海马组织转移至离  心管中,加入等量0.25%的胰酶(美国Sigma公司),37 ℃消化30 min,中间振摇1或2次,加入10%的  DMEM/F12(美国Gibco公司)5 ml,轻轻吹打15次,然后1 000 r · min-1离心5 min,制成单细胞悬液,置于CO2 培养箱(德国Heraeus公司产品)中,差速贴壁30min,去除成纤维细胞,吸取未贴壁的细胞,并用200目  的不锈钢滤网过滤,收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中,然后至离心管中,取一滴单细胞悬液进行计数,并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1,然后接种于200 μg·ml-1多聚赖氨酸(美国Sigma公司)包被的6孔培养板中,转移至培养箱内培养,4 h后换为  无血清培养基,即含2% B27的Neurobasl培养基(美国Gibco公司),以后每3天半量换液1次。使用培养  6 d的神经元进行染色鉴定。  

  1.2 大鼠海马神经元的鉴定 

  1.2.1 烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色

  取培养6 d 6孔培养板中的盖玻片进行神经元特异的NSE免  疫组织化学染色。弃去培养液,4%多聚甲醛室温固定1 h ,加入 0.3% H2O2甲醇去除内源性过氧化氢酶,0.1% TritonX-100破膜,10%绵羊血清封闭,加入一抗1∶200 兔抗鼠 NSE抗体,4 ℃湿盒过夜,0.01 mmol ·L-1PBS清洗,加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG,放入 37 ℃温箱孵育 60 min;0.01 mmol · L-1    PBS 清洗,滴加SABC过氧化物酶复合物,37 ℃温箱中孵育 60 min,0.01 mmol · L-1PBS清洗,滴加 DAB显色液作用3~10 min,自来水冲洗后,常规脱水,透明封片。光镜下观察NSE表达阳性细胞。 

  1.2.2 尼氏染色

  6孔培养板的细胞培养7d时,取出盖玻片进行尼氏染色。弃去培养液,0.01 mmol · L-1PBS清洗,4%多聚甲醛室温固定1 h,0.01 mmol · L-1PBS清洗 3次,氯仿中1 min,95%、70%乙醇各1 min,  蒸馏水清洗,置于1%甲苯胺蓝染液中染色20 min,95%乙醇分化,在显微镜下观察控制,时间以尼氏体显示清晰为准,37 ℃干燥,二甲苯透明,中性树脂封片,光学显微镜下观察。
  
  1.3 实验分组 

  在培养的第3天加入氟西汀(常州第四制药厂生产),根据药物浓度不同,将实验细胞分为5组,分别加  入1、10、20、40 μmol · L-1氟西汀;正常对照组加入等体  积的培养基。  

  1.4 海马细胞形态定量分析 

  倒置相差显微镜(德国Zeiss公司产品)下观察加  药48 h后的海马神经元形态,每组各孔随机选择20个视野(每个视野0.17 mm2),记录每个视野内细胞长出突起的神经元数目,目镜测微尺随机测量15个神经元突起的长度和胞体的长径。  

  1.5  统计学处理 

  应用SPSS12.0软件进行统计分析,各项检测结果以x-±s 表示。多组比较及组间两两比较采用方差分析。   

  2 结  果   

  2.1 海马神经元形态学观察 

  倒置相差显微镜下观察,培养1 d,细胞绝大部分贴壁,细胞形态大小不一,以单突起的小细胞为主。培  养6 d,神经元胞体较大,突起进一步增多、延长,并形成稀疏的网络(图1)。培养12 d,神经元胞体进一步增  大,突起形成比较稠密的网络。培养24 d,神经元胞体出现空泡,部分神经元死亡,胞体崩解,突触断裂。  

  2.2 海马神经元鉴定 

  NSE免疫细胞化学染色:染色后光镜下观察第6  天的神经细胞,胞浆和突起被染成棕黄色为NSE抗体  表达阳性细胞,以3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度,经鉴定神经元的纯度为  90%。见图2A。

  2.3 氟西汀对海马神经元形态学的影响 

  结果见表1和图3。不同浓度的氟西汀对海马神  经元形态学指标的影响是不同的,10 μmol · L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比,有突起的神经元数  目增加、最长突起长度增长( P <0.05); 40 μmol · L-1  氟西汀组海马神经元与正常对照组相比,有突起神经  元数目减少( P <0.05),最长突起长度及胞体长径无  显著性差异( P >0.05);1、20 μmol · L    -1    氟西汀组海马  神经元与正常对照组相比,有突起神经元数目、最长突  起长度及胞体长径无显著性差异( P >0.05)。 表1  氟西汀对加药48 h海马神经元形态学的影响(略)

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