梅花鹿鹿茸、鹿托盘及鹿骨水溶性总蛋白比较研究


                 作者:唐任能,赵雨,孙晓迪,曲晓波

   【摘要】  目的:比较鹿茸、鹿托盘、鹿骨水溶性总蛋白差异。方法:采用SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳和BCATM蛋白含量测定法比较鹿茸、鹿托盘、鹿骨水溶性总蛋白差异。结果:鹿茸水溶性总蛋白、鹿托盘水溶性总蛋白和鹿骨水溶性总蛋白的相对含量及组成差异极其明显,SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳法及BCATM蛋白含量测定法是鉴别鹿茸、鹿托盘及鹿骨有效方法。结论:本研究对鉴别鹿茸、鹿托盘、鹿骨粉具有一定的意义。

   【关键词】  鹿茸;鹿托盘;鹿骨;水溶性总蛋白质

  1  材料仪器

  1.1  材料  梅花鹿茸、鹿托盘和鹿骨均由吉林东丰药业提供。低分子量标准蛋白质,购于中国科学院上海生物化学研究所;BCATM(二辛可宁酸或二羧基喹啉)蛋白浓度试剂盒,购于美国Pierce公司;其他试剂均为分析纯。

  1.2  仪器  Heto LL3000型冻干机,瑞典Jouna Nordic公司;电泳仪,北京六一仪器厂;垂直板电泳槽,北京六一仪器厂;高速离心机,Eppendorf公司。

  2  实验方法

  2.1  总蛋白的提取  取等量干品鹿茸、鹿托盘和鹿骨用车床机粉粹成细粉(120目)即可。分别取鹿茸粉,鹿托盘粉,鹿骨粉100 g,用20mM TrisHCl pH8.0(含0.1 mol  NaCl、1 mmol EDTA、1 mmol PMSF)缓冲液浸提(4℃×24 h),离心(10020 rpm×5 min),即得上清;沉淀用上述缓冲液反复浸提3次,离心(100 20 rpm×5 min),合并上清,用80%硫酸铵沉淀,静置(4℃×24 h),离心(100 20 rpm×5 min),将沉淀用蒸馏水透析,冻干即得鹿茸水溶性总蛋白,鹿托盘水溶性总蛋白和鹿骨水溶性总蛋白粗品。

  2.2  蛋白含量测定  使用PIERCE公司生产的BCATM蛋白试剂盒测定浓度。

  2.3  SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳  按文献方法[2],采用溶度为10%的分离胶和溶度为5%的溶缩胶,溶缩胶电压为70 mV,分离胶电压为140 mV。采用考马斯亮蓝R250进行染色,最后用脱色液(甲醇∶冰醋酸∶蒸馏水=4.5∶4.5∶1)脱色,至背景清楚,观测分子量范围。

  3  结果

  3.1  梅花鹿鹿茸、鹿托盘及鹿骨水溶性总蛋白含量测定  各取100 g梅花鹿鹿茸粉、鹿托盘粉及鹿骨粉得到水溶性蛋白粗品分别为17.1g、8.0 g、 0.1 g,使用PIERCE公司生产的BCATM蛋白试剂盒测定浓度,粗品蛋白中蛋白含量分别为93%、88%、73%。

  3.2  SDSPAGE电泳  可见鹿茸水溶性总蛋白明显可见有8条带,其分子量大约分别为110KD、100KD、66KD、51KD、43KD、35KD、30KD、14KD。从带上看,含量最高的是分子量为66KD的蛋白;其次分子量为14KD的蛋白。

   鹿托盘水溶性总蛋白明显可见有11条带,其分子量大约分别为110KD、100KD、66KD、51KD、43 KD、30KD、23KD、17KD、16KD、14KD,10KD。从带上看,含量最高的是分子量为66KD的蛋白;其次分子量为51KD的蛋白。    鹿骨水溶性总蛋白几乎无明显可见的蛋白带(见表1)。

  4  讨论

  目前,对鹿茸、鹿托盘、鹿骨临床疗效物质作用基础研究较少,特别是对于鹿茸、鹿托盘、鹿骨中大分子进行评价,为临床应用提供表1  鹿茸、鹿托盘和鹿骨的蛋白谱带分布相对分子量10KD14K16KD17KD23KD30KD35KD43KD51KD66KD100KD110KD鹿  茸MWWWWSWW鹿托盘WWWWWWWMSWW鹿  骨[11]W    注:S:strong;M:medium;W:weak。蛋白质研究几乎没有文献报道。蛋白质是生命的物质基础,每一种蛋白质都有特定的生物学功能[3]。经SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳比较鹿茸、鹿托盘、鹿骨蛋白差异发现:鹿骨里几乎无明显可见的蛋白谱带,鹿托盘具有与鹿茸相同的7条蛋白带,其分子量分别约为110KD,100KD,66KD,51KD,43KD,30KD,14KD。同时鹿托盘存在4条特异性蛋白带,其分子量分别为10KD,16KD,17KD,23KD;鹿茸本身也具有它独有的蛋白,其分子量为35KD。研究结果显示鹿茸、鹿托盘和鹿骨的蛋白成分差异大。由于鹿茸、鹿托盘和鹿骨的应用差别很大,因此这种差别可能就是由于它们所含蛋白差别所致。因此我们的这一工作,为以后进一步深入研究鹿茸、鹿托盘、鹿骨的作用机理及新药开发研究奠定很好的基础。

  目前在市场上,鹿茸粉、鹿托盘粉、鹿骨粉几乎很难区别开来,大量存在以劣充好,相互掺杂的现象,很难用性状鉴别、薄层鉴别、理化鉴别、粉末显微鉴别[4]等方法鉴别。由研究结果可见,SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳是鉴别鹿茸粉,鹿托盘粉,鹿骨粉的快速,有效方法,更为以后的指纹图谱鉴定提供一个很好的依据。

   【参考文献】

     [1]黄兆胜.中药学[M].北京:人民卫生出版社,2002:6.

  [2]杨璐璐,迟 程,秦 非,等.鹿茸的化学成分与药理作用[J].云南中医学院学报,1995,18(4):19.

  [3]王继峰.生物化学[M].北京:中国中医药出版社,2002:2951.

  [4]范 青,刘 辉,王萍萍,等.聚丙烯酰铵凝胶电泳在鹿血与其他动物血鉴别中的应用[J].中医药学报,2000,28(5):3940.